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3D Nanoimaging
三維納米成像（3D Nanoimaging）和單分子跟蹤系統（升級Olympus 共焦顯微鏡）
Overview
在過去的幾年里，人們已經設計了幾種方法來使用光學顯微鏡（STED，PALM，STORM）獲得具有納米分辨率的細胞特征圖像。這些方法雖然功能強大，但在檢測圖像中稀疏的納米結構時效率很低。同時，它們也不足以探測納米級三維結構中亞秒級的化學反應動力學，這些結構是不斷移動和改變形狀的。
在納米成像方法達到超分辨率的情況下，激光束不會像光柵圖像那樣按照預定的模式掃描樣品。相反，激光掃描成像基于反饋算法，在掃描過程中，根據待成像物體的形狀連續地調整和確定激光束跟隨的路徑。該算法將激光光斑移動到離物體表面一定距離的位置，由于激光光斑的位置和離物體表面的距離是已知的參數，所以利用這些參數來重建物體的形狀。
三維細胞結構可以在幾秒鐘內分辨率達到20-40納米，精度為2納米。
How it work?
使用SMT（Single-Molecule Tracking）納米成像的操作順序很簡單：首先，獲取感興趣區域的共焦圖像；然后，用戶識別要成像的對象。SMT納米成像通過開關激活，激光束位于距離物體中心100-200納米的位置。當激光光斑接近待成像表面時，熒光量增加。然而，熒光強度的增加取決于距離以及熒光團的濃度和它們各自的量子產率。為了將距離效應與濃度效應分開，點的位置被迫垂直于表面振蕩。也就是說，熒光強度在振蕩過程中發生變化（圖1）。
Figure 1. 調制跟蹤技術示意圖。束點圍繞物體以圓形軌道運動，其與物體表面的距離以設定的頻率周期性地變化；通常，對于每個軌道，振蕩次數在8到32之間，取決于物體的大小。這些半徑的小振蕩被用來計算軌道的調制函數，從中可以確定光斑與表面的距離。
調制函數定義為由于表面的局部熒光而使交替部分與平均部分之比。實際上，調制是PSF的空間導數與強度的比值。調制函數隨著離表面距離的函數呈準線性增加，這一特性允許它用于確定沿軌道激光光斑離表面的距離。通過這種方法，計算并重建物體的橫向形狀。
Tracking Methodology | XY-axis using galvo-controlled mirrors Z-axis using piezo-controlled stage |
Maximum Resolution | 20 nm ± 2 nm |
Data Acquisition Frequency | 32 to 256 KHz |
Circular Orbit Frequency | 2 KHz |
Detector | Internal PMT of FV1000/FV1200 |
Detection Electronics | ISS Photon Counting Unit |
Computer | 3 GHz， 4GB RAM， 200 GB hard drive， 27" monitor (minimum specifications shown) |
Acquisition and Analysis Software | SimFCS by Globals Unlimited |
下面是納米成像單元及其與FV1000共焦顯微鏡的連接示意圖。開關盒允許用戶在標準操作模式下操作FV1000，或激活納米成像系統。在納米成像操作中，FV1000的振鏡通過國際空間站提供的電子設備進行控制。該信號由FV1000的內部探測器收集并轉移到ISS光子計數數據采集單元。使用FV1000的振鏡在XY平面上跟蹤分子，并通過壓電控制級在z軸上跟蹤分子。儀表控制、數據采集和顯示在單獨的計算機上完成。
右側部分包括儀器組件（PC、控制電子設備、掃描儀和激光發射器）。示意圖的左側部分包括ISS隨升級包提供的組件.
可參看文獻：
Nanometer-scale Imaging by the Modulation Tracking Method
Lanzano， L.， Digman， M.A.， Fwu， P.， Giral， H.， Levi， M.， Gratton， E.
J Biophotonics， 2011， 4(6)， 415-24.
Measurement of Distance with the Nanoscale Precise Imaging by Rapid Beam Oscillation Method
Lanzano， L.， Gratton， E.
Microsc Res Tech， 2012， 75(9)， 1253-64.
Real-time Multi-Parameter Spectroscopy and Localization in Three-Dimensional Single-Particle Tracking
Hellriegel， C.， Gratton， E.
J R Soc Interface， 2009， 6， Suppl 1:S3-14.
Real-time Nanomicroscopy Via Three-Dimensional Single Particle Tracking
Katayama， Y.， Burkacky， O.， Meyer， M.， Bráuchle， C.， Gratton， E.， Lamb， D.C.
Chemphyschem， 2009， 10(14)， 2458-64.
Distance Measurement by Circular Scanning of the Excitation Beam in the Two-Photon Microscope
Kis-Petikova， K.， Gratton， E.
Microsc Res Tech， 2004， 63(1)， 34-49.
